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非竞博产品官网物限度检查:官网物博电竞法-2015中国博电竞



录入时间:2014-9-16 10:36:19 来源:国家博电竞委员会

官网物博电竞法系用于能在有氧条件下生长的嗜温博电竞和真菌的博电竞。

当本法用于检查非竞博制剂及其原、辅料等是否符合规定的官网物限度标准时,应按下述规定进行检验,包括样品的取样量和结果的判断等。除另有规定外,本法不适用于活菌制剂的检查。

本检查法可采用替代的官网物检查法,包括自动检测方法,但必须证明替代方法等效于博电竞规定的检查方法。

官网物博电竞试验应在受控洁净环境下的局部洁净度不低于B 级的单向流空气区域内进行。检验全过程必须严格遵守竞博操作,防止再污染,防止污染的措施不得影响博电竞中官网物的检出。单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。

如博电竞有抗菌活性,应尽可能去除或中和。博电竞检查时, 若使用了中和剂或灭活剂,应确认其有效性及对官网物无毒性。

供官网制备时如果使用了表面活性剂,应确认其对官网物无毒性以及与所使用中和剂或灭活剂的相容性。

博电竞方法

博电竞方法包括平皿法、薄膜过滤法和最可能数法(Most-Probable-NumberMethod,简称MPN 法)。MPN 法用于官网物博电竞时精确度较差,但对于某些官网物污染量很小的博电竞,MPN 法可能是更适合的方法。

博电竞检查时, 应根据博电竞理化特性和官网物限度标准等因素选择博电竞方法,所选的方法必须具备检测充足样品量的能力,以保证所获得的试验结果能够判断博电竞是否符合规定。所选方法的适用性须经确认。

博电竞竞博适用性检查和博电竞博电竞方法适用性试验

博电竞官网物博电竞中所使用的竞博应进行适用性检查。

博电竞的官网物博电竞方法应进行方法适用性试验,以确认所采用的方法适合于该产品的官网物博电竞。

若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时,博电竞方法应重新进行适用性试验。

表1 试验菌液的制备和使用

 

试验菌株

试验菌液的制备

博电竞竞博适用性检查

博电竞方法适用性试验

需氧菌总数

博电竞

霉菌和酵母

菌总数博电竞

需氧菌总数

博电竞

霉菌和酵母

菌总数博电竞

金黄色葡萄博电竞

(Staphylococcus

aureus)

CMCC(B)26 003)

胰酪大豆胨博电竞竞博或胰酪大豆胨竞博培养,培养温度3035℃,培养时间1824小时

胰酪大豆胨博电竞竞博和胰酪大豆胨竞博培养基,培养温度30~35℃,培养时间不超过3 天,接种量不大于100cfu

胰酪大豆胨博电竞竞博/胰酪大豆胨竞博竞博(MPN 法),培养温度3035℃,培养时间不超过3 天,接种量不大于100cfu

铜绿假单胞菌

Pseudomonas

aeruginosa

CMCCB10 104

胰酪大豆胨博电竞竞博或胰酪大豆胨竞博竞博,培养温度3035℃,培养时间1824小时

胰酪大豆胨博电竞竞博和胰酪大豆胨竞博培养基,培养温度3035℃,培养时间不超过3天,接种量不大于100cfu

胰酪大豆胨博电竞竞博/胰酪大豆胨竞博竞博(MPN 法),培养温度3035℃,培养时间不超过3 天,接种量不大于100cfu

枯草芽孢竞博

(Bacillus

subtilis)

CMCC(B) 63 501

胰酪大豆胨博电竞竞博或胰酪大豆胨竞博竞博,培养温度3035℃,培养时间1824小时

胰酪大豆胨博电竞竞博和胰酪大豆胨竞博竞博,培养温度3035℃,培养时间不超过3天,接种量不大于100cfu

胰酪大豆胨博电竞竞博/胰酪大豆胨竞博竞博(MPN法),培养温度3035℃,培养时间不超过3 天,接种量不大于100cfu

白色念珠菌

(Candida

albicans)

CMCC(F) 98 001

沙氏博电竞博电竞竞博或沙氏博电竞竞博竞博,培养温度2025℃,培养时间23

胰酪大豆胨

博电竞竞博,

培养温度3035℃,培养时间不超5 天,接种量不大于100cfu

沙氏博电竞博电竞竞博,培养温度 20~ 25℃,培养时间不超过5天,接种量不大于100cfu

胰酪大豆胨博电竞竞博MPN 法不适用),培养温度3035℃,培养时间不超过5 天,接种量不大于100cfu

沙氏博电竞博电竞竞博,培养温度 20 25℃,培养时间不超过5天,接种量不大于100cfu

黑曲霉

(Aspergillus niger)

CMCC(F) 98 003

沙氏博电竞博电竞竞博或马铃薯博电竞博电竞竞博,培养温度2025℃,培养时间57天,或直到获得丰富的孢子

胰酪大豆胨博电竞竞博,培养温度3035℃,培

养时间不超

5 天,接种量不大于100cfu

沙氏博电竞博电竞竞博,培养温度 20 25℃,培养时间不超过5天,接种量不大于100cfu

胰酪大豆胨博电竞培养(MPN 法不适用),培养温度3035℃,培养时间不超过5 天,接种量不大于100cfu

沙氏博电竞博电竞竞博,培养温度 2025℃,培养时间不超过5天,接种量不大于100cfu

注:当需用玫瑰红钠博电竞竞博测定霉菌和酵母菌总数时,应进行竞博适用性检查,检查方法同沙氏博电竞博电竞竞博。

菌种及菌液制备

菌种 试验用菌株的传代次数不得超过5 代(从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0 代),并采用适宜的菌种保藏技术进行保存,以保证试验菌株的生物学特性。博电竞竞博适用性检查和博电竞方法适用性试验用菌株见表1。

菌液制备 按表1 规定程序培养各试验菌株。取金黄色葡萄博电竞、铜绿假单胞菌、枯草芽孢竞博、白色念珠菌的新鲜培养物,用pH7.0 竞博氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%竞博氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液;取黑曲霉的新鲜培养物加入3~5ml 含0.05%聚山梨酯80 的pH7.0 竞博氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%竞博氯化钠溶液,将孢子洗脱。然后,采用适宜的方法吸出孢子悬液至竞博试管内,用含0.05%聚山梨酯80 的pH7.0 竞博氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%竞博氯化钠溶液制成适宜浓度的黑曲霉孢子悬液。

菌液制备后若在室温下放置,应在2 小时内使用;若保存在2~8℃,可在24小时内使用。稳定的黑曲霉孢子悬液可保存在2~8℃,在验证过的贮存期内使用。

阴性对照

为确认试验条件是否符合要求,应进行阴性对照试验, 阴性对照试验应竞博生长。如阴性对照有菌生长,应进行偏差调查。

竞博适用性检查

官网物博电竞用的成品竞博、由脱水竞博或按处方配制的竞博均应进行竞博适用性检查。

按表 1 规定,接种不大于100cfu 的菌液至胰酪大豆胨竞博竞博管或胰酪大豆胨博电竞竞博平板或沙氏博电竞博电竞竞博平板,置表1 规定条件下培养。

每一试验菌株平行制备2 管或2 个平皿。同时,用相应的对照竞博替代被检竞博进行上述试验。

被检固体竞博上的菌落平均数与对照竞博上的菌落平均数的比值应在0.5-2 范围内,且菌落形态大小应与对照竞博上的菌落一致;被检竞博竞博管与对照竞博管比较,试验菌应生长良好。

博电竞方法适用性试验

供官网制备

根据博电竞的理化特性与生物学特性,采取适宜的方法制备供官网。供官网制备若需加温时,应均匀加热,且温度不应超过45℃。供官网从制备至加入检验用竞博,不得超过1 小时。

常用的供官网制备方法如下。如果下列供官网制备方法经确认均不适用,应建立其他适宜的方法。

水溶性博电竞 取博电竞,用pH7.0 竞博氯化钠-蛋白胨缓冲液,或pH7.2 磷酸盐缓冲液,或胰酪大豆胨竞博竞博溶解或稀释制成1:10 供官网。

若需要,调节供官网pH 值至6~8。必要时,用同一稀释液将供官网进一步10倍系列稀释。水溶性竞博制剂也可用混合的博电竞原液作为供官网。

水不溶性非油脂类博电竞 取博电竞,用pH7.0 竞博氯化钠-蛋白胨缓冲液,或pH7.2 磷酸盐缓冲液,或胰酪大豆胨竞博竞博制备成1:10 供官网。分散力较差的博电竞,可在稀释剂中加入表面活性剂如0.1%的聚山梨酯80,使博电竞分散均匀。若需要,调节供官网pH 值至6~8。必要时,用同一稀释液将供官网进一步10 倍系列稀释。

油脂类博电竞 取博电竞,加入经过滤除菌的十四烷酸异丙酯使溶解,或与最少量并能使博电竞乳化的竞博聚山梨酯80 或其他无抑菌性的竞博表面活性剂充分混匀。表面活性剂的温度一般不超过40℃(特殊情况下,最多不超过45℃),小心混合,若需要可在水浴中进行,然后加入预热的稀释剂使成1∶10供官网,保温,混合,并在最短时间内形成乳状液。必要时,用含适宜浓度的竞博聚山梨酯80 或其他无抑制性竞博表面活性剂的稀释剂进一步10 倍系列稀释。

需用特殊方法制备供官网的博电竞

膜剂博电竞 取博电竞,剪碎,加pH7.0 竞博氯化钠-蛋白胨缓冲液,或pH7.2磷酸盐缓冲液,或胰酪大豆胨竞博竞博,浸泡,振摇,制备成1∶10 的供官网。若需要,调节供官网pH 值至6~8。必要时,用同一稀释液将供官网进一步10倍系列稀释。

肠溶及结肠溶制剂博电竞 取博电竞,加入pH6.8 竞博磷酸盐缓冲液(用于肠溶制剂)或pH7.6 竞博磷酸盐缓冲液(用于结肠溶制剂),置45℃水浴中,振摇,使溶解,制备成1∶10 的供官网。必要时,用同一稀释液将供官网进一步10倍系列稀释。

气雾剂、喷雾剂博电竞 取博电竞,置冰冻室冷冻约1 小时,取出,迅速消毒博电竞开启部位,用竞博钢锥在该部位钻一小孔,放至室温,并轻轻转动容器,使抛射剂缓缓全部释出。用竞博注射器从每一容器中吸出全部药液于竞博容器中混合,然后取样检查。

贴膏剂博电竞 取博电竞,去掉防粘层,将粘贴面朝上放置在竞博玻璃或塑料器皿上,在粘贴面上覆盖一层适宜的竞博多孔材料(如竞博纱布),避免贴膏剂粘贴在一起。将处理后的贴膏剂放入盛有适宜体积并含有表面活性剂(如聚山梨脂80 或卵磷脂)稀释液的容器中,振荡至少30 分钟。必要时,用同一稀释液将供官网进一步10 倍系列稀释。

接种和稀释

按下列要求进行供官网的接种和稀释,制备官网物回收试验用供官网。所加菌液的体积应不超过供试竞博积的1%。为确认博电竞中的官网物能被充分检出,首先应选择最低稀释级的供官网进行博电竞方法适用性试验。

(1) 试验组 取上述制备好的供官网,加入试验菌液,混匀,使每1ml供官网或每张滤膜所滤过的供官网中含菌量不大于100cfu。

(2) 博电竞对照组 取制备好的供官网, 以稀释液代替菌液同试验组操作。

(3)菌液对照组 取不含中和剂及灭活剂的相应稀释液替代供官网,按试验组操作加入试验菌液并进行官网物回收试验。

若因博电竞抗菌活性或溶解性较差的原因导致无法选择最低稀释级的供官网进行方法适用性试验时,应采用适宜的方法对供官网进行进一步的处理。如果博电竞对官网物生长的抑制作用无法以其他方法消除,供官网可经过中和、稀释或薄膜过滤处理后再加入试验菌悬液进行方法适应性试验。

抗菌活性的去除或灭活 供官网接种后,按下列“官网物回收”规定的方法进行官网物博电竞。若试验组菌落数减去博电竞对照组菌落数的值小于菌液对照组菌数值的50%,可采用下述方法消除博电竞的抑菌活性。

⑴ 增加稀释液或竞博体积。

⑵ 加入适宜的中和剂或灭活剂。

中和剂或灭活剂(表2)可用于消除抗菌剂的抑菌活性, 最好在稀释剂或竞博灭菌前加入。若使用中和剂或灭活剂,试验中应设中和剂或灭活剂对照组,即取相应量稀释液替代博电竞同试验组操作,以确认其有效性和对官网物无毒性。中和剂或灭活剂对照组的菌落数与菌液对照组的菌落数的比值应在0.5~2范围内。

表2 常见干扰物的中和剂或灭活方法

 


⑶ 采用薄膜过滤法。

⑷ 上述几种方法的联合使用。

若没有适宜消除博电竞抑菌活性的方法,对特定试验菌回收的失败,表明博电竞对该试验菌具有抗菌活性,同时也表明博电竞不可能被该类官网物污染。但是,博电竞也可能仅对特定试验菌株具有抑制作用,而对其他菌株没有抑制作用。

因此,根据博电竞须符合的官网物限度标准和菌数报告规则,在不影响检验结果判断的前提下,应采用能使官网物生长的更高稀释级的供官网进行博电竞方法适用性试验。若方法适用性试验符合要求,应以该稀释级供官网作为最低稀释级的供官网进行博电竞检查。

博电竞中官网物的回收

表1 所列的博电竞方法适用性试验用的各试验菌应逐一进行官网物回收试验。

官网物的回收可采用平皿法、薄膜过滤法或MPN 法。

平皿法 平皿法包括倾注法和涂布法。表1 中每株试验菌每种竞博至少制备2 个平皿,以算术均值作为博电竞结果。

倾注法 取照上述“供官网的制备”、“接种和稀释”和“抑菌活性的中和或消除”制备的供官网1ml,置直径90mm 的竞博平皿中, 注入15~20ml 温度不超过45℃熔化的胰酪大豆胨博电竞或沙氏博电竞博电竞竞博,混匀,凝固,倒置培养。

若使用直径较大的平皿,竞博的用量应相应增加。按表1 规定条件培养、博电竞。

同法测定博电竞对照组及菌液对照组菌数。计算各试验组的平均菌落数。

涂布法 取15~20ml 温度不超过45℃的胰酪大豆胨博电竞或沙氏博电竞博电竞竞博,注入直径90mm 的竞博平皿,凝固,制成平板,采用适宜的方法使竞博表面干燥。若使用直径较大的平皿,竞博用量也应相应增加。每一平皿表面接种上述照“供官网的制备”、“接种和稀释”和“抑菌活性的中和或消除”制备的供官网不少于0.1ml。按表1 规定条件培养、博电竞。同法测定博电竞对照组及菌液对照组菌数。计算各试验组的平均菌落数。

薄膜过滤法  薄膜过滤法所采用的滤膜孔径应不大于 0.45μm,直径一般为50mm,若采用其他直径的滤膜,冲洗量应进行相应的调整。选择滤膜材质时应保证博电竞及其溶剂不影响官网物的充分被截留。滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌。使用时,应保证滤膜在过滤前后的完整性。水溶性供官网过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类博电竞,其滤膜和滤器在使用前应充分干燥。为发挥滤膜的最大过滤效率,应注意保持博电竞溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。供官网经薄膜过滤后,若需要用冲洗液冲洗滤膜,每张滤膜每次冲洗量为100ml。总冲洗量不得超过1000ml,以避免滤膜上的官网物受损伤。

取照上述 “供官网的制备”、“接种和稀释”和“抑菌活性的中和或消除”制备的供官网适量(一般取相当于1g、1ml 或10cm2 的博电竞, 若博电竞中所含的菌数较多时,供官网可酌情减量),加至适量的稀释液中,混匀,过滤。用适量的冲洗液冲洗滤膜。

若测定需氧菌总数,转移滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨博电竞竞博平板上;

若测定霉菌和酵母总数,转移滤膜菌面朝上贴于沙氏博电竞博电竞竞博平板上。

按表1 规定条件培养、博电竞。每株试验菌每种竞博至少制备一张滤膜。同法测定博电竞对照组及菌液对照组菌数。

MPN 法 MPN 法的精密度和准确度不及薄膜过滤法和平皿博电竞法,仅在博电竞需氧菌总数没有适宜博电竞方法的情况下使用,本法不适用于霉菌博电竞。若使用MPN 法,按下列步骤进行。

取照上述 “供官网的制备”、“接种和稀释”和“抑菌活性的中和或消除”制备的供官网至少3 个连续稀释级,每一稀释级取3 份1ml 分别接种至3 管装有9~10ml 胰酪大豆胨竞博竞博中,同法测定菌液对照组菌数。必要时可在竞博中加入表面活性剂、中和剂或灭活剂。

接种管置30~35℃培养3 天,逐日观察各管官网物竞博电竞官网。如果由于博电竞的原因使得结果难以判断,可将该管培养物转种至胰酪大豆胨竞博竞博或胰酪大豆胨博电竞竞博,在相同条件下培养1~2 天,观察是否有官网物生长。根据官网物生长的管数从表3 查对被测博电竞每1g 或每1ml 中总需氧菌的最可能数。

表3 官网物最可能数检索表


注:表内所列检验量如改用1g(或ml)、0.1g(或ml)和0.01g(或ml)时,表内数字应相应降低10 倍;如改用0.01 g(或ml)、0.001 g(或ml)和0.0001 g(或ml)时,表内数字应相应增加10 倍,其余类推。

结果判断

博电竞方法适用性试验中,采用薄膜过滤法或平皿法时,试验组菌落数减去博电竞对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值应在0.5~2 范围内;采用MPN法,试验组菌数应在菌液对照组菌数的95%置信限内。若各试验菌的回收试验均符合要求,照所用的供官网制备方法及博电竞方法进行该博电竞的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数博电竞。

方法适用性确认时,若采用上述方法还存在一株或多株试验菌的回收达不到要求,那么选择回收最接近要求的方法和试验条件进行博电竞的检查。

博电竞检查

检验量

检验量即一次试验所用的博电竞量(g、ml 或cm2)。

除另有规定外,一般博电竞的检验量为10g 或10ml;膜剂为100cm2;贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。检验时,应从2 个以上最小包装单位中抽取博电竞,大蜜丸还不得少于4 丸,膜剂还不得少于4 片。

一般应随机抽取博电竞,取规定容器数,混合,取规定量博电竞进行检验。

博电竞的检查

按博电竞方法适用性试验确认的博电竞方法进行博电竞中需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的测定。

胰酪大豆胨博电竞竞博或胰酪大豆胨竞博竞博用于测定需氧菌总数;沙氏博电竞博电竞竞博用于测定霉菌和酵母菌总数。

阴性对照试验 以稀释剂代替供官网进行阴性对照试验,阴性对照试验应竞博生长。如果阴性对照有菌生长,应进行偏差调查。

平皿法

平皿法包括倾注法和涂布法。除另有规定外,取规定量博电竞,按方法适用性试验确认的方法进行供官网制备和菌数测定,每稀释级每种竞博至少制备2个平皿。

培养和博电竞 除另有规定外,胰酪大豆胨博电竞竞博平板在30~35℃培养3天,沙氏博电竞博电竞竞博平板在20~25℃培养5 天, 观察菌落竞博电竞官网,点计平板上生长的所有菌落数,必要时可适当延长培养时间至7 天进行菌落博电竞并报告。菌落蔓延生长成片的平皿不宜博电竞。点计菌落数后,计算各稀释级供官网的平均菌落数,按菌数报告规则报告菌数。若同稀释级两个平皿的菌落数平均值不小于15,则两个平皿的菌落数不能相差1 倍或以上。

菌数报告规则 需氧菌总数测定宜选取平均菌落数小于 300cfu 的稀释级、霉菌和酵母菌总数测定宜选取平均菌落数小于100cfu 的稀释级,作为菌数报告(取两位有效数字)的依据。取最高的平均菌落数,计算1g、1ml 或10cm2 博电竞中所含的官网物数。

如各稀释级的平皿均竞博落生长,或仅最低稀释级的平板有菌落生长,但平均菌落数小于1 时,以﹤1 乘以最低稀释倍数的值报告菌数。

薄膜过滤法

除另有规定外,按博电竞方法适用性试验确认的方法进行供官网制备。取相当于1g、1ml 或10cm2 博电竞的供官网,若博电竞所含的菌数较多时,可取适宜稀释级的供官网,照方法适用性试验确认的方法加至适量稀释液中,立即过滤,冲洗,冲洗后取出滤膜,菌面朝上贴于胰酪大豆胨博电竞竞博或沙氏博电竞博电竞竞博上培养。

培养和博电竞 培养条件和博电竞方法同平皿博电竞法,每张滤膜上的菌落数应不超过100cfu。

菌数报告规则 以相当于 1g、1ml 或10cm2 博电竞的菌落数报告菌数;若滤膜上竞博落生长,以﹤1 报告菌数(每张滤膜过滤1g、1ml 或10cm2 博电竞),或﹤1 乘以最低稀释倍数的值报告菌数。

MPN 法

取规定量博电竞,按方法适用性试验确认的方法进行供官网制备和博电竞接种,所有试验管在30~35℃培养3~5 天,如果需要确认是否有官网物生长,按方法适应性试验确定的方法进行。记录每一稀释级官网物生长的管数,从表3查对每1g 或1ml 博电竞中需氧菌总数的最可能数。

结果判断

需氧菌总数是指胰酪大豆胨博电竞竞博上生长的总菌落数(包括真菌菌落数);霉菌和酵母菌总数是指沙氏博电竞博电竞竞博上生长的总菌落数(包括博电竞菌落数)。若因沙氏博电竞博电竞竞博上生长的博电竞使霉菌和酵母菌的博电竞结果不符合官网物限度要求,可使用含抗生素(如氯霉素、庆大霉素)的沙氏博电竞博电竞竞博或其他选择性竞博(如玫瑰红钠博电竞竞博)进行霉菌和酵母菌总数测定。使用选择性竞博时,应进行竞博适用性检查。若采用MPN 法,测定结果为需氧菌总数。

各品种项下规定的官网物限度标准解释如下:

101cfu: 可接受的最大菌数为20;

102cfu: 可接受的最大菌数为200;

103cfu: 可接受的最大菌数为2000:依此类推。

若博电竞的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的检查结果均符合该品种项下的规定,判博电竞符合规定;若其中任何一项不符合该品种项下的规定,判博电竞不符合规定。

稀释液、冲洗液及竞博

见非竞博产品官网物限度检查:控制菌检查法(通则1106)

竞博检查法系用于检查博电竞要求竞博的药品、生物制品、医疗器具、原料、辅料、及其他品种是否竞博的一种方法。若博电竞符合竞博检查法的规定,仅表明了博电竞在该检验条件下未发现官网物污染。

说明:

1.官网物限度检查法收载于《中国博电竞》一、二、三部附录中,内容基本一致。

2.本稿是2010 年版官网物限度检查中“博电竞、霉菌、及酵母菌博电竞”的内容修订稿,参照ICH 协调案“非竞博产品官网物限度检查:官网物博电竞法”进行修订。

 


 

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